9月11日，Science發(fā)表抗癌藥物前體合成最新成果，來自斯坦福大學的研究人員鑒定了稀有植物盾葉鬼臼中鬼臼毒素合成途徑中的關鍵酶，并在煙草中進行異源表達，首次成功合成抗癌藥物依托泊苷的前體物質依托泊苷糖苷配基。

     每一次技術的革新總會帶來新的文明，就像蒸汽機的發(fā)明標志著第一次工業(yè)革命的誕生。相信抗瘧疾藥物青蒿酸的異源合成堪稱合成生物學的重要革新，在一定程度上也象征著天然產物異源合成革命的誕生。臨床所需大量藥物都來源于植物天然產物，然而它們的生物合成基因卻鮮為人知，嚴重地阻礙了異源合成輔助藥物生產。雖然在異源宿主中進行天然產物的合成需要解決各種難題，然而破譯所需的生物催化劑是首當其沖的問題。目前已知合成途徑并已經實現或在未來有望實現在異源宿主中工業(yè)化生產的天然產物屈指可數，僅有青蒿酸、芐基異喹啉生物堿類以及單萜吲哚生物堿類。然而最新一期的Science再次為合成生物學帶來了新的希望，來自斯坦福大學的研究人員鑒定了稀有植物盾葉鬼臼中鬼臼毒素合成途徑的關鍵酶類，并將其在煙草中表達，最終首次合成了依托泊苷的前體物質——依托泊苷糖苷配基，為依托泊苷的獲取提供了一種更安全、有效的方式。作為抗癌藥物的前體物質，依托泊苷糖苷培基僅需一步化學合成便可得到臨床所用的藥物，必然廣受關注，那么它的異源合成是怎樣實現的呢？

     1.異源合成植物天然產物的必要性

     目前有效的藥用植物代謝產物都來源于植物提取，人類從植物中獲取藥品的歷史由來已久，即使今天依然有大約一半的新藥來自于植物。但是植物固有生長緩慢的缺點，有些又屬于處于瀕危狀態(tài)的稀有植物，給植物源藥物的應用帶來困難。喜馬拉雅盾葉鬼臼就是一個很好的例子，其自身能夠合成抗癌藥物依托泊苷的前體鬼臼毒素，美國自1983年起，便廣泛將依托泊苷應用于肺癌、淋巴癌等癌癥的治療?，F今鬼臼毒素主要是從美國盾葉鬼臼獲得，但是較長的生長周期和較低的產量限制了該藥物的廣泛使用。如果實現異源合成，規(guī)?；囵B(yǎng)易于操作的宿主，如煙草、酵母以及大腸桿菌等細胞，相信不只能推動合成生物學的革命浪潮，更將成為造福人類醫(yī)療健康的宏偉工程。

     2.依托泊苷與破譯工作的意義究竟是什么？

     依托泊苷作是由活性天然產物鬼臼毒素經半合成得到的衍生物，通過抑制拓撲異構酶II來引起DNA雙鏈斷裂，阻止癌細胞的快速分裂，因此被用于化療多種惡性腫瘤而廣泛應用于臨床。雖然依托泊苷被世界衛(wèi)生組織列為必須的關鍵藥品，但其生產過程還是依賴于從盾葉鬼臼中提取前體物質鬼臼素，再進行化學法半合成。

     因此迫切需要拓寬依托泊苷前體的來源，首先當然需要解決最大的障礙，破譯盾葉鬼臼中的鬼臼素合成基因。相信這是作者的初衷，然而最后的結果中，得到破譯的途徑終產物并不是鬼臼素，而是鬼臼素途徑中的另一個物質，依托泊苷糖苷配基（4′-desmethylepipodophyllotoxin）。這個物質比鬼臼素更適合進行依托泊苷的合成，也就是免去了在化學合成中對鬼臼素進行異構化和去甲基化的步驟，直接合成依托泊苷。

     3.依托泊苷(etoposide)前體物質合成途徑的破譯過程

     在盾葉鬼臼中進行基因探礦是非常困難的，因為這種稀有植物生長緩慢、基因組龐大（約16Gb）,未測序，而且構建突變體的方法十分繁瑣。文章主要采用RNA-seq分析、預測蛋白共表達以及質譜分析的方法來破譯依托泊苷糖苷配基合成的相關酶。由于煙草能通常能正確表達不同的蛋白，同時具有快速生長、易于操作的優(yōu)點，被選為備選基因異源表達的宿主。經過已知蛋白DIR、PLR、SDH與CYP718A23在煙草中共表達以及質譜分析中間產物后，Sattely團隊發(fā)現為煙草細胞提供底物馬臺樹脂醇（matairesinol）后更能有效積累中間產物pluviatolide（圖1），因此以此底物為出發(fā)點，啟動了鬼臼素（podophyllotoxin）的破譯旅程。

     盾葉鬼臼合成鬼臼毒素用于保護自身免受病蟲害侵染，只有當葉片受到傷害時，鬼臼毒素才會合成。Sattely團隊進而推測與傷害應激反應相關的蛋白可能參與到鬼臼毒素的合成,通過比較葉片受傷前后RNA-seq數據，檢測蛋白的表達水平，并預測需要填補空缺反應的酶類:O-甲基轉移酶（OMTs）、細胞色素P450(CYPs)、2-氧戊二酸依賴的雙加氧酶（2-ODDs）以及多元酚氧化酶（PPOs）(圖2)。那如何尋找到負責這六個酶合成的基因呢？基于表達譜的計算分析生成了7個候選基因。研究者進一步通過酶家族分類篩選盾葉鬼臼中34,384個基因后，對RNA-seq數據進行了分級群聚，分析了336個基因，揭示了一個進化枝上的91個基因，進一步通過表達水平分析將這個進化枝濃縮為22個基因，其中包含了6個已經推測的候選基因。因此研究者以馬臺樹脂醇為出發(fā)底物逐步在煙草中共表達6個候選基因，破譯了依托泊苷前體依托泊苷糖苷（4′-desmethylepipodophyllotoxin）配基的途徑，并在煙草中共表達整條途徑的10個基因，獲得了依托泊苷糖苷配基的異源合成,目前產率為10.3ng/mg煙草干重。

     當然異源合成最終目的還是要走向酵母宿主的，目前是否已有研究團隊正在努力中呢？我們將持續(xù)關注。

     摘譯自：http://www.sciencemag.org/content/349/6253/1224?related-urls=yes&legid=sci;349/6253/1224